Western blott

WESTERN BLOTT ?Los conceptos de importancia seran subrayados! Dentro de las aplicaciones de la electroforesis encontramos tres tecnicas que toman importancia en este momento, nos referimos entonces a SOTHERN BLOTT (ADN), NOTHER BLOTT (RNA) Y WESTERN BLOTT (PROTEINAS). El SOTHERN BLOTT es una tecnica se basa en la propiedad que tiene el ADN de migrar atravez de un gel de electroforesis aprovechando la cargas negativas que generan los grupos fosfatos. Ver figura 1) Por tanto esta tecnica inicia a traves de una muestra que puede ser sangre- semen-saliva pues lo que buscamos es ADN. El ADN debe recibir un tratamiento con endonucleasa para asi fragmentarlo y permitir su corrida atravez del agar, (recuerden que la corrida electroforetica se basa en la capacidad de la molecula negativa de buscar su polo contrario, asi mismo las moleculas de mayor tamano seran retenidas al inicio y las de menor tamano difundiran facilmente).

Una vez se tiene la electroforesis del ADN, este se desnaturaliza en disolucion alcalina para obtenerlo de forma monocatenario. Luego se relaiza la electrotranferencia (este concepto se profundizara mas adelante) a una membrana de nailon. Una vez en la membran se agrega una sonda radioactiva que es complementaria a una secuencia especifica de

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ADN ? de ahi la importancia de monocatenario! Permitiendo identificar si el paciente presenta el gen de interes, por lo que este tipo de tecnicas son tan especificas.

El revelado, permite visualizar la reaccion de la sonda con el ADN, puesto que la reaccion no la podemos ver a simple vista por lo que necesitamos realizar una tecnica llamada autoradigrafia. Esta tecnica permite detectar moleculas marcadas radioactivamente, para tal fin se utilizan emulsiones o placas fotograficas sensibles a la radiacion, de forma tal que la plata que contiene la emulsion precipita en presencia de la radiacion como plata metalica, permitiendo observar las bandas en la placa. na banda representa que existen genes especificos en el paciente (“positivo”), si no existen bandas es que no hay genes de interes por tanto sera “negativo”. EL NOTHERN BLOTT es una tecnica similar al Sothern, solo que no buscamos ADN, trabajamos es con RNA, que al igual que el ADN tiene cargas negativas por lo que en estas tecnicas no son necesarios los componentes como el SDS .

WESTERN BLOTT, ( ver video immunoblott)es una tecnica que se basa en la electrotransfrecencia de las proteinas hacia una membrana sintetica , seguido de una deteccion de las proteinas por un proceso de tincion de blott (Ac-enzima-sustrato) , es decir que el Western Blott aprovecha las propiedades que confiere el SDS a las proteinas, para realizar la transferencia de las proteinas desde el gel de poliacrilamida a las membranas sinteticas, fundamentandose en el principio de la electroforesis . Las proteinas negativas que se encuentran ubicadas en el gel de poliacrilamida seguiran hacia el anodo +), permitiendo la movilizacion en las membranas. Una vez se encuentren las proteinas en la membrana, se realiza la deteccion de estas por medio de anticuerpos especificos contra la proteinas que son de nuestro interes o de valor diagnostico. Los anticuerpos se encuentran marcados con una enzima que permitira observar las bandas cuando la pongo en presencia de un sustrato. Si el sustrato se observara a simple vista es Cromogenico, si es de tipo Fluorescente se debera utilizar una camara CCD para su revelado, y por ultimo si el sustrato es Quimioluminiscente se utiliza tecnicas como la autoradiografia para el revelado.

Recomendable ver este video: http://www. youtube. com/watch? v=nqspgMGNsrU&feature=related Los pasos importantes en un Western blott son los siguientes: ELECTROTRANSFERENCIA: si bien la electrotransfrecencia es el proceso en el cual realizamos la transferencias de las proteinas que se encuentran en el gel de poliacrilamida a una membrana sintetica. Debemos tener en cuenta varios aspectos; en primer lugar la electrotrasnferencia se lleva a cabo en una cubeta plasticas que contiene un buffer Tris y dos electrodos planos que se conectan con una resistencia electrica.

El bufer cumple con la funcion de generar una corriente ionica que permite llevar a cabo la electro transferencia, claro esta que para producir una corriente electrica debemos utilizar una resistencia genere un voltaje, que sera aumentado o disminuido segun de la velocidad con la que el laboratorista desee que se realice la electrotransferencia . El gel se debe colocar junto con la membrana sintetica, siempre mirando asi el anodo (+), el gel y la membran se deben disponer en un sistema llamado sandwich, donde la capa mas externa sera una tapa plastica con poros, luego una esponja, un papel filtro y finalmente la membrana y el gel.

Es importante juntar muy bien la membrana al gel de lo contrario se podrian generar burbujas que afectaria mi resultado. A este punto se preguntaran ? porque usar una membrana? Las membranas se utilizan con varios fines; en primer lugar una membrana sintetica genera un soporte fisico que se puede manipular facilmente a diferencia de los geles, en segundo lugar permite al manipulador tenir y destenir repetidas veces. Pero el argumento por el cual se utiliza es porque los anticuerpos no tienen buen acceso al antigeno cuando se realiza directamente sobre el gel de poliacrilamida.

Las membranas mas utilizadas son; Membranas de nylon: las membranas de nylon tienen la ventaja de ser reutilizables, sin embrago en la practica se utilizan poco, pues se bloquean con mas dificultad y algunas proteinas no se unen bien a la membrana. Por tanto se generan muchos falsos positivos. Membrana de nitrocelulosa: estas membranas son ampliamente utilizadas, se asocian con pocos background, y tiene una buena union con las proteinas. Membranas de PVDF (polyvinilidene ifluroide): son las que se utilizan actualmente, estas membranas presentan mayor resistencia que las otras, ademas de tener una excelente union con las proteinas, conserva su estabilidad quimica, solo se hay un pequeno inconveniente, es que se humedece con dificultad. Las membranas tienen un grosos aproximado de 0. 4mm, Por su caracter hidrofobico requieren un tratamiento previo con metanol para activar sus puntos activos de union a las proteinas, la union con las proteinas se basan en interacciones hidrofobias y enlaces covalentes.

TINCION: una vez se ha realizado la electrotranferencia, y tenemos nuestras proteinas en la membrana sinteticas, utilizamos algunos colorantes como el Azul de coomassie o rojo de ponceau para verificar que la transferencia se realizo correctamente, y no gastar reactivo en caso de no ser asi. El Azul de coomassi es un colorante organico que genera una interaccion electrostatica con los grupos aminos de las proteinas permitiendo la visualizacion de las bandas.

BLOQUEO: una vez comprobada la transferencia la membrana se destine con metanol, se procede a relizar un bloqueo de la membrana con BSA (albumina serica bovina) o leche descremada, para evitar que los anticuerpos se unan inespecificamente a otros puntos de la membrana y se eviten falsos positivos. El Tween 20 es un detergente que se ha utilizado en combinacion con agentes como la leche descremada aumentando su accion bloqueante. AC PRIMARIO: se procede a adicionar un anticuerpo primario, por tanto se adiciona el suero del paciente, que contiene anticuerpos que reconocen puntos especificos de las proteinas que se encuentran en las membranas.

AC SECUNDARIO (conjugado): el anticuerpo secundario es sencillamente un anticuerpo anti IG humana que se encuentra marcado con una enzima, la enzima puede ser Fosfasa Alcalina o peroxidasa de rabano (HRP), ellas en presencia de un sustrato generan una reaccion que permite visualizar las bandas. ?Es comun en investigacion utilizar un anticuerpo marcado directamente contra la membrana, pues para estos casos el investigador solo desea conocer si la proteina existe en la muestra analizada! SUSTRATOS: CROMOGENICOS; los sustratos generan una reaccion de color que permite observar las bandas a simple vista, un sustrato ampliamente utilizado es el 4 -CHLORO-1 –NAPHTHOL que en presencia de la enzima HRP forma un precipitado de color azul – negro • QUIMIOLUMINICENTES: se basa en la capacidad que tiene un sustrato como el luminol de producir luz a traves de una reaccion quimica, por tanto el luminol cuando se oxida en presencia de HRP se excita, emitiendo luz a una longitud de onda de 428 nm . para visualizar las bandas se utiliza la tecnica de auto radiografia. FLUORESCENTES : los sustratos fluorescentes son aquellos que tienen una longitud de onda de excitacion y otra de emision , por tanto se utilizan camaras como CCD que producen luz ultravioleta para poder visualizar las bandas. LAVADOS: los lavados se producen durante el proceso de adicion del anticuerpo primario y secundario, con el fin de eliminar el exceso de anticuerpos o de reactivo. Para los lavados se utilizan sustancias como el Tween 20 y Buffer fosfato. APLICACION: para el diagnostico de VIH, se utiliza como prueba confirmatoria el Western blott, pues como hemos visto es una tecnica muy sensible y especifica.

Pues a diferencia del ELISA el western blott identifica anticuerpos que se unen especificamente frente a proteinas del VIH. Si bien el ELISA detecta la union del anticuerpo frente a sitios antigenicos del VIH, no se puede saber con seguridad a que proteinas se estan uniendo los anticuerpos del paciente. Para considerar una prueba de western blott positiva el paciente debe tener al menos 2 bandas de reaccion en las glucoproteinas gp 160, 120 y 40 que son glucoproteinas de la envoltura del virus, (gen env).

Puede tener o no bandas en las proteinas de los genes pol y gag. Negativa cuando no existen bandas. Indeterminada cuando existen bandas que no cumplen con los criterios de positividad. Estos criterios son segun la OMS. les recomiendo hacer la evaluacion: http://www. biology. arizona. edu/IMMUNOLOGY/activities/western_blot/w_problems. html POSITIVO NEGATIVO INDETERMINADO [pic]